smallRNA測序

一、測序技術發(fā)展現(xiàn)狀

　　根據(jù)發(fā)展歷史、影響力、測序原理和技術不同等，主要有以下幾種：大規(guī)模平行簽名測序(Massively Parallel Signature Sequencing, MPSS)、聚合酶克隆(Polony Sequencing)、454焦磷酸測序(454 pyrosequencing)、Illumina(Solexa) sequencing、ABI SOLiD sequencing、離子半導體測序(Ion semiconductor sequencing)、DNA納米球測序(DNA nanoball sequencing)等。

高通量測序技術的應用

　　隨著第二代測序技術的迅猛發(fā)展，科學界也開始越來越多地應用第二代測序技術來解決生物學問題。比如在基因組水平上對還沒有參考序列的物種進行重頭測序(de novo sequencing)，獲得該物種的參考序列，為后續(xù)研究和分子育種奠定基礎;對有參考序列的物種，進行全基因組重測序(resequencing)，在全基因組水平上掃描并檢測突變位點，發(fā)現(xiàn)個體差異的分子基礎。在轉(zhuǎn)錄組水平上進行全轉(zhuǎn)錄組測序(whole tranome resequencing)，從而開展可變剪接、編碼序列單核苷酸多態(tài)性(cSNP)等研究;或者進行小分子RNA測序(small RNA sequencing)，通過分離特定大小的RNA分子進行測序，從而發(fā)現(xiàn)新的microRNA分子。在轉(zhuǎn)錄組水平上，與染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)和甲基化DNA免疫共沉淀(MeDIP)技術相結(jié)合，從而檢測出與特定轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的DNA區(qū)域和基因組上的甲基化位點。

　　需要特別指出的是第二代測序結(jié)合微陣列技術而衍生出來的應用--目標序列捕獲測序技術(Targeted Resequencing)。這項技術首先利用微陣列技術合成大量寡核苷酸探針，這些寡核苷酸探針能夠與基因組上的特定區(qū)域互補結(jié)合，從而富集到特定區(qū)段，然后用第二代測序技術對這些區(qū)段進行測序。目前提供序列捕獲的廠家有Agilent和Nimblegen，應用最多的是人全外顯子組捕獲測序?？茖W家們目前認為外顯子組測序比全基因組重測序更有優(yōu)勢，不僅僅是費用較低，更是因為外顯子組測序的數(shù)據(jù)分析計算量較小，與生物學表型結(jié)合更為直接。

　　目前，高通量測序開始廣泛應用于尋找疾病的候選基因上。內(nèi)梅亨大學的研究人員使用這種方法鑒定出Schinzel-Giedion 綜合征中的致病突變，Schinzel-Giedion綜合征是一種導致嚴重的智力缺陷、腫瘤高發(fā)以及多種先天性畸形的罕見病。他們使用AgilentSureSelect序列捕獲和SOLiD對四位患者的外顯子組進行測序，平均覆蓋度為43倍，讀長為50 nt，每個個體產(chǎn)生了2.7-3 GB可作圖的序列數(shù)據(jù)。他們聚焦于全部四位患者都攜帶變異體的12個基因，最終將候選基因縮小至1個。而貝勒醫(yī)學院基因組測序中心也計劃對15種以上疾病進行研究，包括腦癌、肝癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、膀胱癌、心臟病、糖尿病、自閉癥以及其他遺傳疾病，以更好地理解致病突變以及突變對疾病的影響。前不久剛剛結(jié)束的Science雜志年度十大科學突破評選中，外顯子組測序名列其中。

　測序技術總結(jié)與展望

　　第一代測序技術憑借其長的序列片段和高的準確率，適合對新物種進行基因組長距框架的搭建以及后期GAP填補，但是成本昂貴，而且難以勝任微量DNA樣品的測序工作。第二代測序技術中，454序列片段最長，比較適合對未知基因組從頭測序，搭建主體結(jié)構，但是在判斷連續(xù)單堿基重復區(qū)時準確度不高。Solexa較454具有通量高、片段短、價位低的特點，可以用于大基因組和小基因組的測序和重測序。Solexa雙末端測序(paired-end sequencing)可以為基因組進一步拼接提供定位信息，但是隨著反應輪數(shù)增加，序列長度和質(zhì)量均有所下降，而且在閱讀AT區(qū)時有明顯錯誤傾向。SOLiD基于雙堿基編碼系統(tǒng)的糾錯能力以及較高的測序通量，適合轉(zhuǎn)錄本研究以及比較基因組學特別是SNP檢測等，但是測序的片段短限制了該技術在基因組拼接中的廣泛應用。第三代測序技術目前正在研發(fā)階段，尚未正式投入使用。

高通量測序：https://www.genewiz.com.cn/Public/Services/Next-Generation-Sequencing

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高通量測序經(jīng)過近十年來的迅猛發(fā)展，已經(jīng)深入到生命科學的各個領域，不僅有力地推動了基礎研究的發(fā)展，也在逐漸征服臨床應用。所謂的高通量測序技術，又名大規(guī)模平行測序，是將DNA（或者cDNA）隨機片段化、加接頭，制備測序文庫，通過對文庫中數(shù)以萬計的克隆(Colony)進行延伸反應，檢測對應的信號，最終獲取序列信息。

與Sanger法為代表的傳統(tǒng)測序法相比，高通量測序技術在處理大規(guī)模樣品時具有顯著的優(yōu)勢，又快（兩天）又多（數(shù)百萬克?。?，成為目前組學研究的主要技術。新一代高通量測序技術的發(fā)展,每天會產(chǎn)生TB甚至更多的數(shù)據(jù)。如何整合分析這些數(shù)據(jù)成為一個更大的難點,是當前生物研究的關鍵步驟, 具有巨大的現(xiàn)實意義。

因此學習和應用數(shù)據(jù)分析已是大勢所趨，為了讓大家更好的了解高通量測序在疾病研究中的應用，解螺旋知識金牌聯(lián)合上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司共同推出了《高通量測序與疾病研究》金牌課程，由美吉生物經(jīng)驗豐富的優(yōu)秀講師進行授課。

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